導(dǎo)讀

在前幾期「代謝π析」中，我們系統(tǒng)探討了雙誘導(dǎo)倉鼠肝S9在亞硝胺類雜質(zhì)遺傳毒性評(píng)估中的核心價(jià)值，以及NDMA、NDEA等陽性對(duì)照的選擇策略[13] 。

然而，Ames試驗(yàn)只是倉鼠S9應(yīng)用版圖中的一角。在藥物雜質(zhì)安全性評(píng)估的完整體系中，還有多個(gè)關(guān)鍵試驗(yàn)需要代謝活化系統(tǒng)的支持——從檢測(cè)基因突變的小鼠淋巴瘤試驗(yàn)（MLA），到評(píng)估染色體損傷的體外染色體畸變?cè)囼?yàn)和微核試驗(yàn)，再到檢測(cè)DNA鏈斷裂的彗星實(shí)驗(yàn)（Comet Assay）[1, 7, 8]，倉鼠S9正在這些領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的價(jià)值。

（圖1：遺傳毒性評(píng)估多元試驗(yàn)體系示意圖（5個(gè)試驗(yàn)））

本期，我們將帶您全面了解雙誘導(dǎo)倉鼠肝S9在更多藥物雜質(zhì)評(píng)估場景中的應(yīng)用，并探討“加強(qiáng)版"遺傳毒性評(píng)估體系的構(gòu)建策略。

一、為什么“加強(qiáng)版"需要多元試驗(yàn)體系？

藥物雜質(zhì)的遺傳毒性評(píng)估，不能僅依賴單一試驗(yàn)。根據(jù)ICH M7(R2）指南，致突變雜質(zhì)的評(píng)估需要綜合細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames）和哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)的數(shù)據(jù) 。

不同試驗(yàn)類型檢測(cè)的遺傳損傷終點(diǎn)不同，對(duì)代謝活化的需求也存在差異（詳見表1）：

（表1：五大遺傳毒性試驗(yàn)對(duì)比表）

劃重點(diǎn)：對(duì)于前致突變物（如亞硝胺類），如果在Ames試驗(yàn)中僅使用大鼠S9可能漏檢，那么在其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)中，同樣需要更高效的代謝活化系統(tǒng)。這正是雙誘導(dǎo)倉鼠肝S9的價(jià)值所在[7, 8, 9, 14, 15]。

二、倉鼠S9在小鼠淋巴瘤試驗(yàn)（MLA）中的應(yīng)用

2.1 MLA：檢測(cè)基因突變的“哺乳動(dòng)物視角"

小鼠淋巴瘤試驗(yàn)（Mouse Lymphoma Assay, MLA）是OECD TG 490[12]認(rèn)可的體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)，通過檢測(cè)L5178Y細(xì)胞tk位點(diǎn)的突變頻率，評(píng)估受試物的致突變性。

與Ames試驗(yàn)使用細(xì)菌不同，MLA使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，能夠：

· 檢測(cè)更廣泛的突變類型（點(diǎn)突變+染色體斷裂）

· 更接近人體細(xì)胞的DNA修復(fù)和代謝環(huán)境

· 為ICH M7的雜質(zhì)分類提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)

2.2 倉鼠S9在MLA中的價(jià)值

研究表明，在MLA中使用倉鼠肝S9作為代謝活化系統(tǒng)，對(duì)于某些前致突變物的檢測(cè)靈敏度顯著優(yōu)于傳統(tǒng)大鼠S9方案。

核心優(yōu)勢(shì)：

2.3 實(shí)操建議：MLA中的倉鼠S9使用參數(shù)

（表2：倉鼠S9在MLA試驗(yàn)中的使用參數(shù)）

三、倉鼠S9在體外染色體畸變?cè)囼?yàn)中的應(yīng)用

3.1 染色體畸變?cè)囼?yàn)：檢測(cè)“看得見"的損傷

體外染色體畸變?cè)囼?yàn)（OECD TG 473）[10]通過顯微鏡觀察中期分裂相細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常，檢測(cè)受試物是否誘導(dǎo)染色體斷裂、交換、環(huán)狀染色體、多倍體等損傷。

這類損傷往往與致癌性直接相關(guān)，是遺傳毒性評(píng)估的重要組成部分。

3.2 倉鼠S9的應(yīng)用價(jià)值

在染色體畸變?cè)囼?yàn)中，代謝活化系統(tǒng)的選擇同樣關(guān)鍵。

數(shù)據(jù)支撐：

· 研究顯示，使用誘導(dǎo)倉鼠肝S9活化系統(tǒng)與誘導(dǎo)SD大鼠肝S9活化系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果接近，均可滿足體外遺傳毒理試驗(yàn)需求

· 對(duì)于依賴CYP2E1活化的前致突變物，倉鼠S9體系表現(xiàn)出更高的致突變檢出率

3.3 實(shí)操建議：染色體畸變?cè)囼?yàn)中的倉鼠S9使用參數(shù)[11] 

（表3：倉鼠S9在染色體畸變?cè)囼?yàn)中的使用參數(shù)）

四、倉鼠S9在體外微核試驗(yàn)中的應(yīng)用

4.1 微核試驗(yàn)：檢測(cè)染色體斷裂的“便捷指標(biāo)"

體外微核試驗(yàn)（OECD TG 487）通過檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中微核的形成頻率，評(píng)估受試物的染色體斷裂或非整倍體誘導(dǎo)能力。相比染色體畸變?cè)囼?yàn)，微核試驗(yàn)更簡便、通量更高。[15]

4.2 倉鼠S9的應(yīng)用價(jià)值

體外微核試驗(yàn)同樣認(rèn)可使用代謝活化系統(tǒng)。倉鼠肝S9因其高CYP酶活性，被推薦用于前致突變物的微核試驗(yàn)評(píng)估[6] 。

最新研究進(jìn)展：

2025年發(fā)表的研究顯示[11]，使用30%倉鼠肝S9結(jié)合TA1535菌株，對(duì)亞硝胺類化合物的檢測(cè)靈敏度高達(dá)90%。 雖然該研究針對(duì)Ames試驗(yàn)，但代謝活化原理同樣適用于微核試驗(yàn)。

4.3 實(shí)操建議：微核試驗(yàn)中的倉鼠S9使用參數(shù)

（表4：倉鼠S9在微核試驗(yàn)中的使用參數(shù)）

五、倉鼠S9在彗星實(shí)驗(yàn)（Comet Assay）中的應(yīng)用

5.1 彗星實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)DNA鏈斷裂的“靈敏探針"

彗星實(shí)驗(yàn)（Comet Assay，又稱單細(xì)胞凝膠電泳）是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA鏈斷裂的靈敏方法。當(dāng)受試物為前致突變物、需要代謝活化才能產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物時(shí)，添加S9代謝活化系統(tǒng)是必要的技術(shù)手段。

（ 圖2：彗星實(shí)驗(yàn)原理及S9代謝活化流程示意圖）

檢測(cè)終點(diǎn)：

· DNA單鏈斷裂

· DNA雙鏈斷裂

· 堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)

· 交聯(lián)損傷（修飾版）

5.2 倉鼠S9在彗星實(shí)驗(yàn)中的價(jià)值

為什么選擇倉鼠S9？

1. 更高的CYP酶活性：Evans等[1]（2025）發(fā)表于《Mutation Research》的研究表明，誘導(dǎo)倉鼠S9的CYP2A6樣活性較誘導(dǎo)大鼠S9高出約60倍。對(duì)于依賴CYP2A6/CYP2E1活化的亞硝胺類化合物，倉鼠S9可顯著提高DNA損傷檢測(cè)靈敏度。

2. 與常用細(xì)胞系的種屬匹配：彗星實(shí)驗(yàn)常用的細(xì)胞系包括V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）、CHL（中國倉鼠肺細(xì)胞）、CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞），均來源于中國倉鼠。使用金黃地鼠（敘利亞倉鼠）肝S9在種屬上更接近，具有更好的生物兼容性。

5.3 方法學(xué)參數(shù)與優(yōu)化建議

在彗星實(shí)驗(yàn)中添加S9代謝活化系統(tǒng)的方法與Ames試驗(yàn)類似，但暴露時(shí)間更長[3][4] [5]：

（表5：倉鼠S9在彗星實(shí)驗(yàn)中的使用參數(shù)）

經(jīng)典文獻(xiàn)支持：Oshida等（2010）在FDC-P2細(xì)胞中使用大鼠肝S9（6%，暴露6小時(shí)）成功檢測(cè)環(huán)磷酰胺和苯并[a]芘的DNA損傷[4] 。該技術(shù)路徑同樣適用于倉鼠S9。

5.4 應(yīng)用場景優(yōu)先級(jí)

（表6：倉鼠S9在彗星實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用場景優(yōu)先級(jí)）

六、構(gòu)建“加強(qiáng)版"遺傳毒性評(píng)估體系

6.1 為什么要“加強(qiáng)"？

傳統(tǒng)遺傳毒性評(píng)估體系（Ames+MLA+微核）對(duì)大鼠S9活化體系已經(jīng)能夠檢出大多數(shù)致突變物。然而，對(duì)于亞硝胺類等依賴特定CYP酶活化的前致突變物，傳統(tǒng)體系存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)[1,7,8,9]。

6.2 倉鼠S9在“加強(qiáng)版"體系中的角色定位[13] 

（表7：倉鼠S9在加強(qiáng)版體系中的角色定位）

6.3 從“單一工具"到“代謝活化矩陣"

隨著監(jiān)管要求的升級(jí)，藥物雜質(zhì)評(píng)估已從“一個(gè)S9走天下"演進(jìn)為“多物種、多濃度、多參數(shù)"的代謝活化矩陣。

齊氏生物的建議策略（詳見下圖）[1, 7, 8, 9, 11]：

（表7：倉鼠S9在加強(qiáng)版體系中的角色定位）

實(shí)操總結(jié)：

（表8：倉鼠S9在不同試驗(yàn)類型中的使用參數(shù)推薦表）

七、案例分享：倉鼠S9在復(fù)雜雜質(zhì)評(píng)估中的多元應(yīng)用

案例1：某ADC藥物連接子雜質(zhì)的全面評(píng)估[16]

背景：某ADC藥物在連接子合成工藝中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)NDSRI雜質(zhì)。

評(píng)估策略：

· Ames試驗(yàn)：使用30%倉鼠S9 + TA1535，檢出陽性

· MLA：使用10%倉鼠S9，確認(rèn)基因突變風(fēng)險(xiǎn)

· 微核試驗(yàn)：使用10%倉鼠S9，評(píng)估染色體斷裂風(fēng)險(xiǎn)

· 彗星實(shí)驗(yàn)：使用6%倉鼠S9 + V79細(xì)胞，確認(rèn)DNA鏈斷裂損傷

結(jié)果：四項(xiàng)試驗(yàn)均呈陽性，雜質(zhì)被歸類為ICH M7 Class 2，需控制在AI限值以下。

案例2：某小分子候選藥物的早期篩選[17]

背景：某小分子候選藥物結(jié)構(gòu)中含有潛在的警示結(jié)構(gòu)。

評(píng)估策略：

· Ames試驗(yàn)：使用30%倉鼠S9 + 10%大鼠S9雙體系，確保無漏檢

· 彗星實(shí)驗(yàn)：使用6%倉鼠S9快速評(píng)估DNA損傷潛力

結(jié)果：Ames試驗(yàn)陰性，彗星實(shí)驗(yàn)陰性，代謝穩(wěn)定性可接受，項(xiàng)目順利推進(jìn)至IND申報(bào)。

注：以上案例基于齊氏生物服務(wù)客戶的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)及行業(yè)典型實(shí)踐整理，具體數(shù)據(jù)已做脫敏處理。

八、齊氏生物：您的一站式遺傳毒性評(píng)估合作伙伴

作為雙誘導(dǎo)金黃地鼠肝S9的專業(yè)供應(yīng)商，齊氏生物為您的遺傳毒性評(píng)估提供全面支持：

8.1 核心產(chǎn)品線

8.2 技術(shù)服務(wù)體系

· 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)支持：協(xié)助客戶優(yōu)化S9濃度、預(yù)孵育/暴露時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)

· 方法驗(yàn)證服務(wù)：使用陽性對(duì)照驗(yàn)證S9批次活性

· NDSRI陽性對(duì)照選擇咨詢：根據(jù)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推薦交叉參照方案

· GLP體系合規(guī)支持：產(chǎn)品符合GLP試驗(yàn)需求，已有國內(nèi)多家GLP安評(píng)機(jī)構(gòu)合作案例

8.3 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

結(jié)語

雙誘導(dǎo)倉鼠肝S9的價(jià)值，遠(yuǎn)不止于Ames試驗(yàn)。

從小鼠淋巴瘤試驗(yàn)（MLA）到染色體畸變?cè)囼?yàn)，從微核試驗(yàn)到彗星實(shí)驗(yàn)，倉鼠S9正在構(gòu)筑藥物雜質(zhì)評(píng)估的“代謝活化矩陣"。在亞硝胺類雜質(zhì)監(jiān)管日趨嚴(yán)格的今天，擁有一個(gè)高效、可靠的代謝活化系統(tǒng)，是確保遺傳毒性評(píng)估不漏檢、合規(guī)申報(bào)的關(guān)鍵保障。

齊氏生物將繼續(xù)致力于提供高品質(zhì)的倉鼠肝S9產(chǎn)品和專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，助力您的藥物研發(fā)項(xiàng)目安全、高效地推進(jìn)。

本期是「代謝π析·倉鼠S9專題」的第4篇。下一期，我們將繼續(xù)探討倉鼠S9在藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中的更多應(yīng)用，敬請(qǐng)期待。

了解更多倉鼠S9產(chǎn)品詳情，或獲取遺傳毒性評(píng)估方案支持，歡迎聯(lián)系齊氏生物。

參考文獻(xiàn)

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